A coloração de Gram é amplamente utilizada em microbiologia, pois é uma das maneiras mais fáceis de diferenciar bactérias com base na composição de sua parede celular. Segundo Gram, todas as bactérias podem ser divididas em gram-positivas (Gram (+)) e gram-negativas (Gram (-)). O método de coloração de Gram foi desenvolvido em 1884 e não perdeu popularidade desde então, embora tenha sido modificado várias vezes.
Estrutura da parede celular
A coloração de Gram revela se uma bactéria é Gram-positiva ou Gram-negativa. A divisão das bactérias em Gram (+) e Gram (-) é realizada de acordo com a estrutura de sua parede celular.
A parede celular contém a maior quantidade de peptidoglicano (mureína) - uma substância complexa, que inclui peptpeptídeo e glicano. O glicano consiste em resíduos alternados de N-acetilglucosamina e ácido N-acetilmurâmico ligados entre si por β-1,ligações 4-glicosídicas. Peptidoglicano fornece manutenção da forma celular, proteção osmótica e funções antigênicas.
Principais diferenças entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
Diferentes bactérias têm diferentes espessuras de camada de peptidoglicano. Nas bactérias classificadas como gram-positivas, varia de 15 a 80 nm, enquanto nas gram-negativas é de 2 a 8 nm. Ao mesmo tempo, as bactérias Gram-negativas têm uma estrutura especial sob a camada de peptidoglicano, que as bactérias Gram-positivas não possuem - o espaço periplasmático. Este espaço é preenchido com enzimas hidrolíticas - β-lactamase, ribonuclease 1, fosfatase. São essas enzimas que são responsáveis pela resistência das bactérias Gram-negativas a muitos antibióticos.
A camada de peptidoglicano Gram(-) das bactérias está ligada ao lipopolissacarídeo, uma estrutura antigênica contendo endotoxina. Nas bactérias Gram(+), os ácidos teicóicos desempenham funções semelhantes.
As bactérias Gram-negativas têm uma estrutura adicional - a membrana externa.
A essência do método de coloração
Antes de começar a coloração, são preparados esfregaços das bactérias estudadas. Para fazer isso, a água é pingada em uma lâmina de vidro e uma cultura de microrganismos é adicionada lá com uma alça bacteriana. Então, depois que a água secar completamente, o esfregaço é fixado - a lâmina de vidro é transportada várias vezes sobre a chama do queimador. A coloração de Gram é mais eficaz do que a coloração de bactérias vivas - as moléculas de corante se ligam melhor às células mortas.
A coloração é feita em várias etapas:
- Pequenos pedaços de papel filtro são colocados em um esfregaço fixo e o corante principal é derramado - violeta de genciana ou azul de metileno.
- Após 3-5 minutos, retire o papel de filtro colorido e encha o esfregaço com solução de Lugol por 1 minuto. Neste caso, a preparação escurece.
- A solução de Lugol é drenada e o esfregaço é tratado com álcool etílico puro: algumas gotas são pingadas na preparação, drenadas após 20 segundos. O procedimento é repetido 2-3 vezes.
- Enxaguar a lâmina com a preparação do teste com água destilada.
- Produza coloração adicional - finalize a preparação com fucsina. Após 1-2 minutos, o corante é lavado.
- Depois que a água secar, examine o esfregaço ao microscópio. Bactérias Gram-positivas serão azul-violeta, bactérias Gram-negativas serão rosa ou vermelhas.
Causas de diferentes padrões de coloração
Como descrito acima, a coloração de Gram de bactérias cora bactérias Gram-positivas azul-violeta e bactérias Gram-negativas vermelho ou rosa. A razão para a coloração diferencial de bactérias por este método é que após a forma solúvel de violeta de genciana entrar na célula, o corante passa para a forma insolúvel de iodo. Durante o tratamento de bactérias com álcool etílico, os lipídios são extraídos da membrana sob a ação desse solvente apolar. A membrana então se torna porosa e não é mais uma barreira significativa para a lixiviação do corante. No entantopeptidoglicano é mais resistente a solventes não polares, incluindo álcool. É ele quem impede a lavagem do corante, então as bactérias com uma espessa camada de mureína ficam azul-violeta (gram-positivas), e após o tratamento com álcool não mudam de cor.
A fina camada de mureína de bactérias gram-negativas não consegue reter as moléculas de corante na célula, então, após a ação do álcool, elas se tornam incolores - coram gram-negativas.
Após a exposição de um esfregaço à fucsina, as bactérias Gram permanecem azul-violeta, enquanto as Gram-negativas tornam-se rosa-avermelhadas.
Exemplos de bactérias Gram(+) e Gram(-)
As bactérias Gram-negativas incluem cianobactérias, bactérias sulfurosas, bactérias ferrosas, clamídia, riquétsias, bactérias acéticas, muitas metilobactérias, bactérias tiônicas, arsenitobactérias, carboxibactérias.
Bifidobactérias, muitas bactérias aquáticas, estreptococos e estafilococos são Gram-positivas.
