Cultivo de bactérias: métodos, princípios, etapas e condições

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Última modificação: 2023-12-17 05:39

Microrganismos na natureza ao nosso redor estão por toda parte: em solos, corpos d'água, nas superfícies de vários objetos, pessoas e animais são habitados por eles. Tudo isso pode servir como fontes de contaminação microbiana de alimentos, medicamentos e linhas de produção. O cultivo de bactérias é necessário para estudar suas propriedades, necessidades e características. Este, por sua vez, é um passo importante no desenvolvimento de vários medicamentos, diagnóstico laboratorial de doenças, cálculo de reatores de produção e muito mais.

Conceitos gerais

Cultivo de bactérias em microbiologia refere-se ao cultivo de microrganismos realizado em laboratório. Por sua vez, os micróbios que cresceram em um meio nutriente selecionado são chamados de cultura. As culturas podem ser misturadas se forem formadas por diferentes tipos de microrganismos, e puras se forem representadas por apenas um tipo de bactéria.

Se nutricionalApenas uma célula é colocada no meio e um grupo de indivíduos é obtido como resultado de sua reprodução, então esse conjunto de microrganismos é chamado de clone. Quando um clone se desenvolve a ponto de se tornar visível a olho nu, essa coleção de bactérias é chamada de colônia.

Normalmente o cultivo de bactérias isoladas de diferentes fontes é realizado separadamente umas das outras. Cada um desses grupos de micróbios cultivados separadamente é chamado de cepa. Então, se um tipo de estafilococo é isolado de três fontes (ou porções diferentes do mesmo produto, pessoas diferentes), eles falam sobre três cepas desse tipo de estafilococo.

Fatores de crescimento de bactérias

Incluem vários aminoácidos, lipídios, bases purinas e outros compostos necessários para o desenvolvimento de microrganismos. Alguns micróbios podem produzir independentemente as substâncias de que precisam, enquanto outros precisam recebê-las na forma final. De acordo com as necessidades dos microrganismos em determinados fatores de crescimento, são realizadas a identificação e diferenciação das bactérias. Além disso, este parâmetro é importante para a correta preparação de um meio nutriente para trabalho laboratorial e biotecnológico:

Aminoácidos. As bactérias podem exigir um determinado aminoácido ou grupo de ácidos. Assim, clostrídios precisam de leucina e tirosina, estreptococos precisam de leucina e arginina. Microrganismos que requerem aminoácidos de fora para crescer são chamados de auxotróficos.
Bases purinas e pirimídicas, bem como seus derivados (adenina, guanina e outros). Eles são um fator importante no crescimento de muitosEspécie de Streptococcus.
Vitaminas. Eles fazem parte das coenzimas exigidas pelas bactérias. Assim, o ácido nicotínico, assim como sua amida, que faz parte do NAD e do NADP, é necessário para as corinebactérias da difteria e da shigella. A tiamina, como parte integrante do pirofosfato, é requerida por Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. O ácido pantotênico, que faz parte da coenzima CoA, é exigido pelos bacilos do tétano e certos tipos de estreptococos. Os citocromos e, portanto, o ácido fólico, hemes e biotina que os formam, são necessários para Mycobacterium tuberculosis e Haemophilus influenzae.

Requisitos ambientais

Condições para meios de cultura para cultura de bactérias:

Nutrição. Além disso, devem conter substâncias de fácil digestão, necessárias para que os microrganismos se alimentem e reponham energia. Estes incluem organógenos e minerais. Alguns microorganismos também requerem vitaminas e aminoácidos que não podem sintetizar.
Nível de pH ideal. Afeta a permeabilidade da membrana celular e, consequentemente, a capacidade de absorção de nutrientes pela bactéria. Na maioria das vezes, o valor do pH deve estar no nível de 7, 2-7, 4. Muitos microrganismos ao longo de sua vida produzem produtos com reações ácidas ou alcalinas, e para que o pH do meio nutriente não mude, ele deve ser armazenado em buffer.
Isotônico. A pressão osmótica no meio nutriente para o cultivo de bactérias deve ter os mesmos valores quedentro das células microbianas. Geralmente corresponde a uma solução de NaCl a 0,5%.
Esterilidade. Isso se deve ao fato de que o aparecimento de bactérias estranhas irá distorcer os resultados do estudo da cepa analisada.
Nível de umidade. Este indicador, juntamente com a consistência do meio, deve ter características ideais para um determinado tipo de bactéria.
Potencial Redox (RH2). Mostra a proporção de substâncias que doam e aceitam elétrons, bem como o nível de saturação de oxigênio do meio nutriente. Para aeróbios e anaeróbios, as condições para o cultivo de bactérias diferem um pouco neste indicador. Microrganismos anaeróbios se reproduzem melhor em valores de RH2 abaixo de 5 e microrganismos aeróbios pelo menos 10.
Uniformidade. É importante que o meio de cultura contenha quantidades constantes de seus ingredientes individuais. Além disso, as soluções claras são preferidas, o que facilita o monitoramento do crescimento das culturas ou a detecção de contaminação.

Tipos de meios de cultura

A escolha de um meio específico para o cultivo de microrganismos é influenciada por diversos fatores, entre eles as características de sua nutrição e o objetivo do estudo. As principais características subjacentes à classificação dos meios nutrientes são:

1. Componentes. De acordo com as substâncias iniciais usadas para criar o substrato, elas distinguem:

naturais, que são preparados a partir de produtos de origem animal ou vegetal (por exemplo, carne, leite, frutas) e são adequados para cultivo mistocolheitas;
semi-sintéticos, em que produtos alimentares naturais caros são substituídos por produtos não alimentares (por exemplo, farinha de ossos, coágulos sanguíneos), e que são ideais para cultivar certos tipos de bactérias ou isolar seus produtos metabólicos do ambiente;
sintéticos, que são preparados a partir de quantidades precisas de compostos químicos, têm uma composição constante conhecida e são facilmente reproduzíveis.

2. Consistência (densidade). Distinguir ambientes:

líquido;
denso;
semilíquido.

Os dois últimos são preparados a partir de soluções especiais ou substâncias líquidas com adição de ágar-ágar ou gelatina para criar a densidade necessária. Além disso, um ambiente denso para o crescimento de bactérias é soro sanguíneo coagulado, batatas, mídia de sílica gel, carragenina.

3. Composto. Com base nisso, os ambientes são:

simples, cuja lista é curta é Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatina nutritiva e água peptonada.
complexo, preparado a partir de simples com adição de sangue, soro de leite, carboidratos e outras substâncias.

4. Compromisso. Os seguintes meios nutrientes são distinguidos:

main são usados para cultivar muitos micróbios patogênicos (geralmente de composição simples);
os especiais são usados para isolar e cultivar bactérias que não crescem em substratos simples;
seletivos (também são seletivos) são adequados para isolar um tipo específico de bactéria e inibir o crescimento de micróbios associados (seletividadecriado pela adição de certas substâncias à mídia, como antibióticos ou sais, ou pelo ajuste do pH);
diagnóstico diferencial permite distinguir um tipo de bactéria de outro avaliando a atividade enzimática, por exemplo, do meio;
conservantes são necessários para a inoculação inicial com posterior transporte das amostras, pois previnem a morte de microrganismos, bem como inibem o crescimento de outras bactérias.

Preparação de mídia

O passo mais importante no cultivo de bactérias anaeróbicas é a preparação de um meio nutriente adequado. Após selecionar os parâmetros ideais, prossiga para as seguintes etapas:

pesagem, selecionando uma amostra de componentes em uma balança analítica;
dissolução realizada em água destilada aquecida a 70°C, e fosfatos, micro e macrosais são dissolvidos separadamente;
ferver em banho-maria por dois minutos;
determinação do pH por papel indicador ou potenciômetro;
filtragem através de pano úmido ou filtros de papel para meios líquidos e densos fundidos, e através de um filtro de gaze de algodão para meios de ágar;
engarrafamento realizado em 3/4 da capacidade;
esterilização dependente do meio;
controle de esterilidade é realizado por dois dias em um termostato, seguido de visualização;
controle químico para estabelecer o pH e o teor deitens;
controle biológico por inoculação experimental.

Esterilização de vidraria e mídia

Um dos princípios básicos do cultivo bacteriano é a esterilidade. O crescimento e desenvolvimento de microrganismos estranhos podem afetar as características do meio nutriente, alterando sua composição química e pH. A esterilização é a principal condição para o cultivo de culturas puras. Na prática, este termo significa os métodos de destruição de absolutamente todas as formas de vida na superfície e no volume de objetos esterilizados. Vasos, instrumentos usados, mídia e outros itens usados durante o estudo são esterilizados.

Alguns tipos de esterilização:

Ignição. Esterilização de alças e agulhas para semeadura, lâminas de vidro, alguns instrumentos podem ser realizados com queimador ou lamparina.
Ebulição. Adequado para manuseio de seringas, agulhas, alimentos, mas não mata esporos bacterianos.
Esterilização por calor seco. É realizado em um gabinete de secagem especial e é adequado para o processamento de frascos, tubos de ensaio e outras vidrarias de laboratório.
Esterilização a vapor. Realizado em autoclave, este método é altamente eficaz. Mas não é adequado para meios nutrientes contendo proteínas ou quaisquer outros compostos que se decompõem em altas temperaturas. Mais economia pode ser chamada de tindalização. É realizado na Caldeira Koch e combina a germinação dos esporos com a sua destruição.
Pasteurização. É usado para meios que alteram suas propriedades quando fervidos (por exemplo, leite, vinho, cerveja), capazes delivrá-los de microorganismos não portadores de esporos. A temperatura de processamento é de apenas 50-60 ° C por quinze a trinta minutos. Em alguns casos, utiliza-se a esterilização a frio, realizada com filtros ou raios UV.

Condições de cultivo de bactérias

O crescimento e desenvolvimento de bactérias só é possível sob certos fatores e os valores de cada um deles:

1. Temperatura. Existem três grupos de bactérias que diferem nas preferências de temperatura:

termófilos, ou micróbios que gostam de calor, crescem a 45-90°C, o que significa que não se multiplicam em organismos humanos e animais;
psicrófilos, ou microorganismos amantes do frio, preferem temperaturas na faixa de 5-15 ° C e são cultivados em câmaras frigoríficas;
mesófilos, desenvolvem-se a uma temperatura de 25-37 ° C, incluem a maior parte das bactérias.

2. Leve. É uma característica do cultivo de bactérias fototróficas, uma vez que realizam o processo fotossintético. Mas para a maioria dos micróbios, a iluminação não é um pré-requisito. E mesmo vice-versa, o ultravioleta solar pode suprimir seu desenvolvimento.

3. Água. Todos os microrganismos precisam de água em uma forma acessível (líquida). É por isso que os alimentos congelados têm pouco ou nenhum crescimento de bactérias.

4. Acidez do ambiente. Este princípio de cultivo de bactérias já foi discutido em detalhes acima.

5. Aeração. O oxigênio, como elemento químico, é parte integrante da água e de um número considerável de compostos utilizados paracultivo de microorganismos. O oxigênio gasoso também pode estar contido na água e outros líquidos na forma dissolvida. Uma parte significativa das bactérias precisa de um suprimento constante de moléculas de oxigênio. Mas para vários microrganismos é desnecessário, ou pior, o oxigênio gasoso é tóxico para eles, pois não possuem catalase e peroxidase, que destroem produtos respiratórios tóxicos. Portanto, o passo mais importante no cultivo de bactérias anaeróbicas é a remoção das moléculas de O₂ do meio nutriente.

6. Cultivo de microorganismos. O cultivo de bactérias aeróbias e anaeróbicas é realizado em diferentes camadas do ambiente e de diferentes modos.

Cultivo de microrganismos aeróbios

O cultivo de bactérias aeróbicas requer oxigênio molecular. Para obter culturas puras de aeróbios que podem ser usadas com sucesso na medicina e na indústria alimentícia, são utilizados os seguintes métodos:

superfície crescendo em meio denso ou em meio líquido (sua camada fina) quando o oxigênio vem diretamente do ar;
cultivo profundo em meio líquido, quando o aumento da quantidade de oxigênio dissolvido neles é obtido por aeração constante.

Cultivo de microrganismos anaeróbios

O princípio básico do cultivo de bactérias desse tipo é seu contato mínimo com o oxigênio atmosférico. Fornecer condições para seu crescimento é muito mais difícil do que para aeróbios. Os seguintes métodos são usados para isolar anaeróbios de O₂:

molecular

Físico. Este método de cultivo de bactérias anaeróbicas é reduzido ao seu cultivo em um aparelho de vácuo especial - um microanaerostato. O ar é substituído por uma mistura gasosa especial de nitrogênio com a adição de 10% de hidrogênio e 5% de dióxido de carbono.
Química. Estes incluem: uso de agentes absorventes (por exemplo, Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ou agentes redutores (como ácido ascórbico).
Biológica. Tudo se resume ao co-cultivo de aeróbios e anaeróbios em um sistema fechado. Este método de cultivo de bactérias envolve semear metade de uma placa de Petri com algumas das espécies de bactérias aeróbicas e a outra metade com o anaeróbio estudado. Seu desenvolvimento começará no momento em que todo o oxigênio se esgotar.

Os seguintes métodos de semeadura são adequados para o cultivo de bactérias anaeróbicas:

na camada superficial;
na camada superficial preenchida com parafina estéril;
na espessura de um meio nutriente denso;
em camadas profundas de meio viscoso.

Obtenção de cultura pura

Microbiologistas geralmente trabalham com amostras habitadas por muitos tipos diferentes de micróbios. No entanto, para determinar a posição sistemática dos microrganismos (família, gênero, espécie), bem como estudar suas características, é necessário isolá-los e cultivar uma cultura pura. São de grande importância em muitas indústrias alimentícias, por exemplo, queijo, pão, kvass, vinho, etc. O cultivo de bactérias lácticas permite obterum componente essencial para a produção de produtos lácteos fermentados, massa, cacau, silagem e até plástico.

O método de isolamento de uma cultura pura em meio denso baseia-se na separação mecânica das células do microrganismo com seu posterior cultivo isolado. A amostra é transferida para um volume estéril de água ou solução salina (volume 10-100 ml) e depois agitada por dois minutos. Para extrair microrganismos localizados na espessura do material em estudo (por exemplo, salsichas ou queijos), primeiro é realizada a fricção das peças de amostra com instrumentos estéreis com areia. O material submetido à preparação preliminar, pesando 1 g ou volume de 1 ml, é diluído em água estéril por 10, 100, 1000, etc. vezes. O grau de diluição é escolhido para fornecer uma concentração de células correspondente às capacidades do método.

O cultivo subsequente de microrganismos é preparar um meio nutriente. Normalmente, um meio denso (MPA) é escolhido. É primeiro derretido e resfriado a 45-50 ° C, e só então é derramado em várias placas de Petri (três a cinco peças), no fundo das quais são colocadas zaragatoas da substância de teste de várias concentrações. Em seguida, é feita a mistura do meio nutriente ainda não congelado e do material nele introduzido. É assim que as células são fixadas em vários pontos do volume do substrato.

Em seguida, as placas de Petri são colocadas em um termostato por 2 dias a 22 °C. Durante esse tempo, as células se multiplicam a tal ponto que a colônia formada por cada uma das células se torna visível a olho nu. Cada um deles é uma cultura pura do tipo de bactéria de cujas célulasrosa.

Depois disso, a partir de placas de Petri, os microrganismos são subcultivados em tubos de ensaio separados preenchidos com um meio nutriente. Desta forma, culturas puras são isoladas de uma amostra mista. Este método leva o nome de seu desenvolvedor - R. Koch. Também é comumente chamado de método do copo, ou semeadura por esgotamento. Após a obtenção de culturas puras de vários tipos de bactérias, sua forma, esporos e famílias são determinados.

Todos os trabalhos devem ser realizados de acordo com os princípios da assepsia. Para evitar o desenvolvimento prematuro de microrganismos, o estudo deve ser realizado imediatamente após a amostragem. A água da torneira é analisada após a drenagem das primeiras porções, pois podem conter micróbios acumulados em canos e torneiras. A microflora de frutas, bagas e vegetais está localizada principalmente na superfície (casca), portanto, as lavagens são realizadas a partir dela. Para fazer isso, coloque o feto em um recipiente estéril e encha-o com a quantidade necessária de água. Em seguida, eles são agitados vigorosamente e a água é despejada em outro recipiente. As colheitas de produtos de tecido também são obtidas em cotonetes, mas antes são cortados pedaços de um determinado tamanho.