O que está por trás da hibridização do DNA? Embora a sequência de DNA de fita dupla seja geralmente estável sob condições fisiológicas, alterar essas condições no laboratório (geralmente aumentando a temperatura ambiente) fará com que as moléculas se separem em fitas individuais. Estas últimas são complementares entre si, mas também podem complementar outras sequências presentes em seu ambiente. Abaixar a temperatura ambiente permite que as moléculas de fita simples se hibridizem ou hibridizem umas com as outras. Este é o método de hibridização de DNA.
O conceito do ponto de vista da biologia molecular
Os cientistas envolvidos tanto na replicação do DNA quanto na transcrição do DNA em RNA contam com cruzamentos de nucleotídeos e técnicas de biologia molecular. Isso inclui Southern e Northern blots, reação em cadeia da polimerase (PCR) e a maioria das abordagens de hibridização e sequenciamento de DNA-RNA.
Aplicativo
Hibridização é a principal propriedade do nucleotídeosequências e é usado em vários métodos de biologia molecular. A relação genética geral de duas espécies pode ser determinada pela hibridização de segmentos de seu DNA (hibridização DNA-DNA). Devido às semelhanças de sequência entre organismos intimamente relacionados, é necessária uma temperatura mais alta para derreter esses híbridos de DNA em comparação com organismos mais distantes. Vários métodos usam a hibridização para determinar a origem de uma amostra de DNA, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Em outro método, sequências curtas de DNA são hibridizadas com mRNA celular para identificar genes expressos. As empresas farmacêuticas estão explorando o uso de RNA antisense para se ligar ao mRNA indesejado, impedindo que o ribossomo traduza o mRNA em proteína.
DNA-DNA hibridização geralmente se refere a uma técnica de biologia molecular que mede o grau de similaridade genética entre pools de sequências de DNA. É comumente usado para determinar a distância genética entre dois organismos. Tem sido amplamente utilizado em filogenia e taxonomia.
Metodologia
DNA de um organismo foi rotulado, então misturado com DNA não rotulado que pode ser comparado a ele. A mistura é incubada para permitir que as fitas de DNA se dissociam e depois resfriam para formar um DNA de fita dupla híbrido regenerado. Sequências hibridizadas com alto grau de similaridade se ligarão mais firmemente e exigirão mais energia para separá-las: ou seja, elas se separam quando aquecidas a uma temperatura mais alta.temperatura do que sequências diferentes, um processo conhecido como "fusão de DNA".
DNA derretido
Avaliando o perfil de fusão do DNA hibridizado, o DNA de fita dupla é ligado a uma chamada "coluna" e a mistura resultante é aquecida. Em cada etapa, a coluna é lavada e as sequências de DNA que se fundem tornam-se em fita simples e lavam a coluna. As temperaturas nas quais o DNA marcado sai da coluna refletem a quantidade de similaridade entre as sequências (e o padrão de auto-dobramento serve como controle). Esses resultados são combinados para determinar o grau de similaridade genética entre os organismos. De acordo com a microbiologia moderna, a hibridização do DNA é impossível sem entender essas coisas.
Quando várias espécies de ácido ribonucleico (ou desoxirribonucleico) são comparadas dessa maneira, os valores de similaridade permitem que as espécies sejam colocadas na árvore filogenética. Portanto, esta é uma das abordagens possíveis para conduzir a sistemática molecular. Charles Sibley e John Ahlquist, os pioneiros desta técnica, usaram a hibridização DNA-DNA para estudar as relações filogenéticas de pássaros (taxonomia de Sibley-Ahlquist) e primatas.
Importância para a biologia
A hibridização DNA-DNA é o padrão ouro para distinguir espécies bacterianas, com um valor de similaridade superior a 70%, indicando que as cepas comparadas pertencem a espécies diferentes. Em 2014, foi proposto um limite de 79% de similaridade para separar uma subespécie bacteriana.
Os críticos afirmam que a técnica é imprecisa para comparar espécies intimamente relacionadas, pois qualquer tentativa de medir diferenças entre sequências ortólogas entre organismos é esmagada pela hibridização de contrapartes parálogas no genoma de um organismo. O sequenciamento de DNA e as comparações de sequências computacionais são atualmente o método comumente usado para determinar a distância genética, embora essa abordagem ainda seja usada em microbiologia para ajudar a identificar bactérias.
A forma atual é realizar a hibridização DNA-DNA em silicone usando genomas total ou parcialmente sequenciados. O GGDC desenvolvido pelo DSMZ é a ferramenta conhecida mais precisa para calcular valores do tipo DDH. Entre outras melhorias algorítmicas, ele resolve o problema com sequências parálogas filtrando-as cuidadosamente de correspondências entre duas sequências genômicas.
método FISH
Fluorescência In Situ Hibridização (FISH) é uma técnica de laboratório usada para detectar e sequenciar DNA, geralmente em um cromossomo específico.
Em 1969, Joseph Gall e Mary Lou Pardu publicaram um artigo demonstrando que cópias radioativas de uma sequência de DNA ribossômico poderiam ser usadas para detectar sequências de DNA complementares no núcleo de um ovo de rã. Desde essas observações originais, muitos refinamentos aumentaram a versatilidade ea sensibilidade do procedimento a tal ponto que a hibridização in situ ("no local", latim) é agora considerada uma ferramenta importante em citogenética. (O termo in situ agora também é usado para se referir ao estágio inicial do crescimento do carcinoma, quando apenas o tecido epitelial está envolvido no processo patológico.)
Sequência de hibridização fluorescente
As sondas de RNA podem ser projetadas para qualquer gene ou qualquer sequência dentro de um gene para visualizar lncRNA e miRNA mRNA em tecidos e células. O FISH é usado para estudar o ciclo de reprodução celular, em particular a interfase nuclear para quaisquer anormalidades cromossômicas. O FISH permite analisar uma grande série de casos de arquivo, é muito mais fácil identificar o cromossomo identificado criando uma sonda com uma base cromossômica artificial que atrairá cromossomos semelhantes.
Sinais de hibridização para cada sonda quando uma anormalidade nuclear é detectada: cada sonda de detecção de mRNA e lncRNA consiste em 20 pares de oligonucleotídeos, cada par cobre um espaço de 40-50 bp. p. As sondas usam química proprietária para detectar mRNA.
Hibridização com sondas de DNA
As sondas são frequentemente feitas de fragmentos de DNA que foram isolados, purificados e amplificados para uso no projeto do genoma humano. O tamanho do genoma humano é tão grande comparado ao comprimento que pode ser sequenciado diretamente que é necessário dividi-lo emfragmentos. Em última análise, esses fragmentos foram ordenados digerindo uma cópia de cada fragmento em unidades ainda menores usando endonucleases específicas de sequência para medir o tamanho de cada fragmento pequeno usando cromatografia de exclusão de tamanho usando essas informações para determinar onde fragmentos grandes se sobrepunham..
Para preservar os elementos com suas sequências de DNA individuais, os fragmentos foram adicionados a um sistema de populações bacterianas sempre repetidas. Populações clonais de bactérias, cada população mantendo um único cromossomo artificial, são armazenadas em vários laboratórios ao redor do mundo. Cromossomos artificiais (BACs) podem ser cultivados, extraídos e rotulados em qualquer laboratório que contenha uma biblioteca. As bibliotecas genômicas geralmente recebem o nome das instituições onde foram desenvolvidas. Um exemplo é a biblioteca RPCI-11, em homenagem ao Roswell Cancer Institute em Buffalo (Nova York, EUA). Esses fragmentos formam cerca de 100 mil pares de bases e são a base da maioria das sondas FISH.
