Os métodos de pesquisa biológica molecular desempenham um grande papel na medicina moderna, forense e biologia. Graças aos avanços no estudo de DNA e RNA, uma pessoa é capaz de estudar o genoma de um organismo, determinar o agente causador de uma doença, reconhecer o ácido nucleico desejado em uma mistura de ácidos, etc.
Métodos de pesquisa biológica molecular. O que é?
Nos anos 70 e 80, os cientistas conseguiram pela primeira vez decifrar o genoma humano. Este evento impulsionou o desenvolvimento da engenharia genética e da biologia molecular. O estudo das propriedades do DNA e do RNA levou ao fato de que agora é possível usar esses ácidos nucléicos para diagnosticar uma doença, estudar genes.
Obtenção de DNA e RNA
Os métodos de diagnóstico biológico molecular requerem a presença de material de partida: mais frequentemente são ácidos nucleicos. Existem várias maneiras de isolar essas substâncias das células dos organismos vivos. Cada um deles tem suas próprias vantagens e desvantagens, e é necessáriolevar em consideração ao escolher um método para isolar ácidos nucleicos puros.
1. Obtenção de DNA de acordo com Marmur. O método consiste em tratar uma mistura de substâncias com álcool, resultando na precipitação de DNA puro. A desvantagem deste método é o uso de substâncias agressivas: fenol e clorofórmio.
2. Isolamento de DNA de acordo com Boom. A principal substância utilizada aqui é o tiocianato de guanidina (GuSCN). Contribui para a precipitação do ácido desoxirribonucleico em substratos especializados, a partir dos quais pode ser coletado posteriormente usando um tampão especial. No entanto, GuSCN é um inibidor de PTC, e mesmo uma pequena parte dele que entra no DNA precipitado pode afetar o curso da reação em cadeia da polimerase, que desempenha um papel importante no trabalho com ácidos nucleicos.
3. Sedimentação de impurezas. O método difere dos anteriores, pois não são as moléculas de ácido desoxirribonucleico que são precipitadas, mas as impurezas. Para fazer isso, os trocadores de íons são usados. A desvantagem é que nem todas as substâncias podem precipitar.
4. Triagem em massa. Este método é utilizado nos casos em que não são necessárias informações exatas sobre a composição da molécula de DNA, mas é necessário obter alguns dados estatísticos. Isso é explicado pelo fato de que a estrutura do ácido nucleico pode ser danificada quando tratada com detergentes, em particular álcalis.
Classificação dos métodos de pesquisa
Todos os métodos de pesquisa em biologia molecular são divididos em três grandes grupos:
1. Amplificação (usando muitas enzimas). Aquirefere-se à PCR - reação em cadeia da polimerase, que desempenha um papel importante em muitos dos métodos de diagnóstico.
2. Não amplificador. Este grupo de métodos está diretamente relacionado ao funcionamento de misturas de ácidos nucleicos. Exemplos são 3 blots, hibridização in situ, etc.
3. Métodos baseados no reconhecimento de um sinal de uma molécula sonda que se liga a um DNA ou RNA sonda específico. Um exemplo é o Sistema de Captura Híbrida (hc2).
Enzimas que podem ser usadas em métodos de pesquisa em biologia molecular
Muitos métodos de diagnóstico molecular envolvem o uso de uma ampla gama de enzimas. Abaixo estão os mais usados:
1. Enzima de restrição - "corta" a molécula de DNA nas partes necessárias.
2. DNA polimerase - sintetiza uma molécula de fita dupla de ácido desoxirribonucleico.
3. Transcriptase reversa (revertase) - usada para sintetizar DNA em um molde de RNA.
4. DNA ligase - responsável pela formação de ligações fosfodiéster entre nucleotídeos.
5. Exonuclease - remove nucleotídeos das seções terminais da molécula de ácido desoxirribonucleico.
PCR é o principal método de amplificação de DNA
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada ativamente na biologia molecular moderna. Este é um método no qual um grande número de cópias pode ser obtido a partir de uma única molécula de DNA (as moléculas são amplificadas).
Principais funções da PCR:
- diagnósticodoenças;
- clonagem de segmentos de DNA, genes.
Os seguintes elementos são necessários para realizar uma reação em cadeia da polimerase: a molécula de DNA inicial, uma polimerase de DNA termoestável (Taq ou Pfu), fosfatos de desoxirribonucleotídeos (fontes de bases nitrogenadas), primers (2 primers por 1 molécula de DNA) e o próprio sistema tampão, no qual todas as reações são possíveis.
PCR consiste em três etapas: desnaturação, recozimento do primer e alongamento.
1. Desnaturação. A uma temperatura de 94-95 graus Celsius, as ligações de hidrogênio entre as duas fitas de DNA são quebradas e, como resultado, obtemos duas moléculas de fita simples.
2. Recozimento primário. A uma temperatura de 50-60 graus Celsius, os primers são ligados às extremidades das moléculas de ácido nucleico de fita simples pelo tipo de complementaridade.
3. Alongamento. A uma temperatura de 72 graus, ocorre a síntese de moléculas filhas de ácido desoxirribonucleico.
Sequenciamento de DNA
Métodos de pesquisa biológica molecular geralmente requerem conhecimento da sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido desoxirribonucleico. O sequenciamento é realizado para determinar o código genético. O diagnóstico molecular do futuro será baseado no conhecimento adquirido com o sequenciamento humano.
Os seguintes tipos de sequenciamento são diferenciados:
- Sequenciamento Maxam-Gilbert;
- Sequenciamento de Sanger;
- pirosequenciamento;
- nanoporosequenciamento.
