O conceito de enzimas imobilizadas apareceu pela primeira vez na segunda metade do século XX. Enquanto isso, em 1916, descobriu-se que a sacarose sorvida no carbono mantinha sua atividade catalítica. Em 1953, D. Schleit e N. Grubhofer realizaram a primeira ligação de pepsina, amilase, carboxipeptidase e RNase com um transportador insolúvel. O conceito de enzimas imobilizadas foi legalizado em 1971. Isso aconteceu na primeira conferência sobre enzimologia de engenharia. Atualmente, o conceito de enzimas imobilizadas é considerado em um sentido mais amplo do que era no final do século XX. Vamos dar uma olhada nesta categoria.
Informações gerais
Enzimas imobilizadas são compostos que são ligados artificialmente a um carreador insolúvel. No entanto, eles mantêm suas propriedades catalíticas. Atualmente, este processo é considerado em dois aspectos - no âmbito da limitação parcial e total da liberdade de movimento das moléculas de proteína.
Dignidade
Os cientistas estabeleceram certos benefícios das enzimas imobilizadas. Atuando como catalisadores heterogêneos, eles podem ser facilmente separados do meio reacional. Como parte da pesquisa, verificou-se que o uso de enzimas imobilizadas pode ser repetido. Durante o processo de vinculação, as conexões alteram suas propriedades. Eles adquirem especificidade e estabilidade do substrato. Ao mesmo tempo, sua atividade passa a depender das condições ambientais. As enzimas imobilizadas são duráveis e têm um alto grau de estabilidade. É maior que, por exemplo, a de enzimas livres em milhares, dezenas de milhares de vezes. Tudo isso garante alta eficiência, competitividade e economia das tecnologias nas quais as enzimas imobilizadas estão presentes.
Mídia
J. Poratu identificou as principais propriedades dos materiais ideais para serem usados na imobilização. Os portadores devem ter:
- Insolubilidade.
- Alta resistência biológica e química.
- A capacidade de ativar rapidamente. As transportadoras devem se tornar facilmente reativas.
- Hidrofilicidade significativa.
- Permeabilidade necessária. Seu indicador deve ser igualmente aceitável para enzimas e coenzimas, produtos de reação e substratos.
Atualmente não há material que atenda totalmente a esses requisitos. No entanto, na prática, são utilizados transportadores adequados para imobilização.determinada categoria de enzimas sob condições específicas.
Classificação
Dependendo de sua natureza, os materiais, em conexão com os quais os compostos são convertidos em enzimas imobilizadas, são divididos em inorgânicos e orgânicos. A ligação de muitos compostos é realizada com carreadores poliméricos. Esses materiais orgânicos são divididos em 2 classes: sintéticos e naturais. Em cada um deles, por sua vez, os grupos são distinguidos dependendo da estrutura. Os transportadores inorgânicos são representados principalmente por materiais feitos de vidro, cerâmica, argila, sílica gel e grafite preto. Ao trabalhar com materiais, os métodos de química seca são populares. As enzimas imobilizadas são obtidas por revestimento de carreadores com um filme de titânio, alumínio, zircônio, óxidos de háfnio ou por processamento com polímeros orgânicos. Uma vantagem importante dos materiais é a facilidade de regeneração.
Carreadores de proteínas
Os mais populares são os materiais lipídicos, polissacarídeos e proteicos. Dentre estes últimos, vale destacar os polímeros estruturais. Estes incluem principalmente colágeno, fibrina, queratina e gelatina. Tais proteínas estão amplamente distribuídas no ambiente natural. Eles são acessíveis e econômicos. Além disso, eles têm um grande número de grupos funcionais para ligação. As proteínas são biodegradáveis. Isso permite expandir o uso de enzimas imobilizadas na medicina. Enquanto isso, as proteínas também têm propriedades negativas. As desvantagens do uso de enzimas imobilizadas em carreadores de proteínas são a alta imunogenicidade deste último, bem comoa capacidade de introduzir apenas certos grupos deles em reações.
Polissacarídeos, Aminossacarídeos
Destes materiais, quitina, dextrana, celulose, agarose e seus derivados são os mais utilizados. Para tornar os polissacarídeos mais resistentes às reações, suas cadeias lineares são reticuladas com epicloridrina. Vários grupos ionogênicos são livremente introduzidos nas estruturas da rede. A quitina acumula-se em grande quantidade como resíduo durante o processamento industrial de camarões e caranguejos. Esta substância é resistente a produtos químicos e possui uma estrutura porosa bem definida.
Polímeros Sintéticos
Este grupo de materiais é muito diversificado e acessível. Inclui polímeros à base de ácido acrílico, estireno, álcool polivinílico, polímeros de poliuretano e poliamida. A maioria deles são mecanicamente fortes. No processo de transformação, eles oferecem a possibilidade de variar o tamanho dos poros dentro de uma faixa bastante ampla, introduzindo vários grupos funcionais.
Métodos de Ligação
Atualmente, existem duas opções fundamentalmente diferentes para imobilização. A primeira é obter compostos sem ligações covalentes com o carreador. Este método é físico. Outra opção envolve o surgimento de uma ligação covalente com o material. Este é um método químico.
Adsorção
Com a ajuda dele, as enzimas imobilizadas são obtidas segurando o medicamento na superfície do carreador devido adispersão, interações hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio. A adsorção foi a primeira forma de limitar a mobilidade dos elementos. No entanto, mesmo agora esta opção não perdeu sua relevância. Além disso, a adsorção é considerada o método de imobilização mais comum na indústria.
Recursos do método
Publicações científicas descrevem mais de 70 enzimas obtidas pelo método de adsorção. Os veículos eram principalmente vidro poroso, várias argilas, polissacarídeos, óxidos de alumínio, polímeros sintéticos, titânio e outros metais. Estes últimos são os mais utilizados. A eficácia da adsorção do fármaco no carreador é determinada pela porosidade do material e pela área de superfície específica.
Mecanismo de ação
A adsorção enzimática em materiais insolúveis é simples. É obtido pelo contato de uma solução aquosa do fármaco com o carreador. Pode passar de forma estática ou dinâmica. A solução enzimática é misturada com sedimento fresco, por exemplo, hidróxido de titânio. O composto é então seco sob condições suaves. A atividade enzimática durante essa imobilização é retida em quase 100%. Ao mesmo tempo, a concentração específica atinge 64 mg por grama de carreador.
Momentos negativos
As desvantagens da adsorção incluem baixa resistência ao ligar a enzima e o transportador. No processo de alteração das condições de reação, pode-se notar perda de elementos, contaminação de produtos e dessorção de proteínas. Para melhorar a forçaos transportadores de ligação são pré-modificados. Em particular, os materiais são tratados com íons metálicos, polímeros, compostos hidrofóbicos e outros agentes polifuncionais. Em alguns casos, a própria droga é modificada. Mas muitas vezes isso leva a uma diminuição em sua atividade.
Inclusão no gel
Esta opção é bastante comum devido à sua singularidade e simplicidade. Este método é adequado não apenas para elementos individuais, mas também para complexos multienzimáticos. A incorporação no gel pode ser feita de duas maneiras. No primeiro caso, o fármaco é combinado com uma solução aquosa do monômero, após o que a polimerização é realizada. Como resultado, aparece uma estrutura de gel espacial, contendo moléculas de enzimas nas células. No segundo caso, o medicamento é introduzido na solução do polímero acabado. É então colocado em um estado de gel.
Intrusão em estruturas translúcidas
A essência deste método de imobilização é a separação de uma solução aquosa de enzima do substrato. Para isso, é utilizada uma membrana semipermeável. Ele permite que elementos de baixo peso molecular de cofatores e substratos passem e retém grandes moléculas de enzimas.
Microencapsulação
Existem várias opções para embutir em estruturas translúcidas. Destes, a microencapsulação e a incorporação de proteínas em lipossomas são de maior interesse. A primeira opção foi proposta em 1964 por T. Chang. Consiste no fato de que a solução enzimática é introduzida em uma cápsula fechada, cujas paredes são feitas de material semipermeávelpolímero. O aparecimento de uma membrana na superfície é causado pela reação de policondensação interfacial de compostos. Um deles é dissolvido no orgânico e o outro - na fase aquosa. Um exemplo é a formação de uma microcápsula obtida por policondensação de haleto de ácido sebácico (fase orgânica) e hexametilenodiamina-1,6 (respectivamente, fase aquosa). A espessura da membrana é calculada em centésimos de micrômetro. O tamanho das cápsulas é de centenas ou dezenas de micrômetros.
Incorporação em lipossomas
Este método de imobilização é próximo da microencapsulação. Os lipossomas são apresentados em sistemas lamelares ou esféricos de bicamadas lipídicas. Este método foi usado pela primeira vez em 1970. Para isolar lipossomas de uma solução lipídica, o solvente orgânico é evaporado. O filme fino restante é disperso em uma solução aquosa na qual a enzima está presente. Durante este processo, ocorre a automontagem de estruturas de bicamada lipídica. Tais enzimas imobilizadas são bastante populares na medicina. Isso se deve ao fato de que a maioria das moléculas está localizada na matriz lipídica das membranas biológicas. As enzimas imobilizadas incluídas nos lipossomas são o material de pesquisa mais importante em medicina, o que permite estudar e descrever os padrões dos processos vitais.
Formação de novos títulos
A imobilização por formação de novas cadeias covalentes entre enzimas e carreadores é considerada o método mais difundido para obtenção de biocatalisadores industriais.destino. Ao contrário dos métodos físicos, esta opção proporciona uma ligação irreversível e forte entre a molécula e o material. Sua formação é frequentemente acompanhada pela estabilização do fármaco. Ao mesmo tempo, a localização da enzima a uma distância da 1ª ligação covalente em relação ao carreador cria certas dificuldades na implementação do processo catalítico. A molécula é separada do material por meio de um inserto. É frequentemente usado como agentes poli e bifuncionais. Em particular, eles são hidrazina, brometo de cianogênio, dialhedrido glutárico, cloreto de sulfuril, etc. Por exemplo, para remover galactosiltransferase, a seguinte sequência é inserida entre o transportador e a enzima -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. Em tal situação, uma inserção, uma molécula e um transportador estão presentes na estrutura. Todos eles estão ligados por ligações covalentes. De fundamental importância é a necessidade de introduzir na reação grupos funcionais que não são essenciais para a função catalítica do elemento. Então, como regra, as glicoproteínas são ligadas ao transportador não através da proteína, mas através da parte do carboidrato. Como resultado, são obtidas enzimas imobilizadas mais estáveis e ativas.
Células
Os métodos descritos acima são considerados universais para todos os tipos de biocatalisadores. Estes incluem, entre outras coisas, células, estruturas subcelulares, cuja imobilização se tornou recentemente generalizada. Isso se deve ao seguinte. Quando as células são imobilizadas, não há necessidade de isolar e purificar as preparações enzimáticas ou introduzir cofatores nas reações. Como resultado, torna-se possívelsistemas que realizam processos contínuos em vários estágios.
Uso de enzimas imobilizadas
Na medicina veterinária, indústria e outros setores econômicos, os medicamentos obtidos pelos métodos acima são bastante populares. As abordagens desenvolvidas na prática fornecem uma solução para os problemas de liberação direcionada de drogas no corpo. Enzimas imobilizadas possibilitaram a obtenção de fármacos de ação prolongada com mínima alergenicidade e toxicidade. Atualmente, os cientistas estão resolvendo os problemas associados à bioconversão de massa e energia usando abordagens microbiológicas. Enquanto isso, a tecnologia de enzimas imobilizadas também contribui significativamente para o trabalho. As perspectivas de desenvolvimento parecem ser bastante amplas. Assim, no futuro, um dos papéis-chave no processo de monitoramento do estado do ambiente deve pertencer a novos tipos de análise. Em particular, estamos falando de métodos bioluminescentes e de imunoensaio enzimático. Abordagens avançadas são de particular importância no processamento de matérias-primas lignocelulósicas. Enzimas imobilizadas podem ser usadas como amplificadores de sinal fraco. O centro ativo pode estar sob a influência de um portador que está sob ultra-som, estresse mecânico ou sujeito a transformações fitoquímicas.
