Proteína é um componente essencial de todos os organismos. Cada uma de suas moléculas consiste em uma ou mais cadeias polipeptídicas que consistem em aminoácidos. Embora a informação necessária para a vida seja codificada em DNA ou RNA, as proteínas recombinantes desempenham uma ampla gama de funções biológicas nos organismos, incluindo catálise enzimática, proteção, suporte, movimento e regulação. De acordo com suas funções no organismo, essas substâncias podem ser divididas em diferentes categorias, como anticorpos, enzimas, componentes estruturais. Dadas suas importantes funções, tais compostos têm sido intensamente estudados e amplamente utilizados.
No passado, a principal forma de obter uma proteína recombinante era isolá-la de uma fonte natural, o que geralmente é ineficiente e demorado. Os avanços recentes na tecnologia molecular biológica tornaram possível clonar o DNA que codifica um conjunto específico de substâncias em um vetor de expressão para substâncias como bactérias, leveduras, células de insetos e células de mamíferos.
Simplesmente, as proteínas recombinantes são traduzidas por produtos de DNA exógeno emcélulas vivas. Obtê-los geralmente envolve duas etapas principais:
- Clonagem de uma molécula.
- Expressão de proteínas.
Atualmente, a produção de tal estrutura é um dos métodos mais poderosos usados em medicina e biologia. A composição tem ampla aplicação em pesquisa e biotecnologia.
Orientação médica
Proteínas recombinantes fornecem tratamentos importantes para várias doenças como diabetes, câncer, doenças infecciosas, hemofilia e anemia. As formulações típicas de tais substâncias incluem anticorpos, hormônios, interleucinas, enzimas e anticoagulantes. Existe uma necessidade crescente de formulações recombinantes para uso terapêutico. Eles permitem expandir os métodos de tratamento.
proteínas recombinantes geneticamente modificadas desempenham um papel fundamental no mercado de medicamentos terapêuticos. As células de mamíferos atualmente produzem a maioria dos agentes terapêuticos porque suas formulações são capazes de produzir substâncias naturais de alta qualidade. Além disso, muitas proteínas terapêuticas recombinantes aprovadas são produzidas em E. coli devido à boa genética, rápido crescimento e alta produtividade. Também tem um efeito positivo no desenvolvimento de medicamentos à base dessa substância.
Pesquisa
A obtenção de proteínas recombinantes é baseada em diferentes métodos. As substâncias ajudam a descobrir os princípios básicos e fundamentais do corpo. Essas moléculas podem ser usadas para identificar e determinarlocalização da substância codificada por um determinado gene e para revelar a função de outros genes em várias atividades celulares, como sinalização celular, metabolismo, crescimento, replicação e morte, transcrição, tradução e modificação dos compostos discutidos no artigo.
Assim, a composição observada é frequentemente usada em biologia molecular, biologia celular, bioquímica, estudos estruturais e biofísicos e muitos outros campos da ciência. Ao mesmo tempo, a obtenção de proteínas recombinantes é uma prática internacional.
Tais compostos são ferramentas úteis na compreensão das interações intercelulares. Eles se mostraram eficazes em vários métodos laboratoriais, como ELISA e imuno-histoquímica (IHC). Proteínas recombinantes podem ser usadas para desenvolver ensaios enzimáticos. Quando usadas em combinação com um par de anticorpos apropriados, as células podem ser usadas como padrões para novas tecnologias.
Biotecnologia
Proteínas recombinantes contendo uma sequência de aminoácidos também são usadas na indústria, produção de alimentos, agricultura e bioengenharia. Por exemplo, na criação de animais, as enzimas podem ser adicionadas aos alimentos para aumentar o valor nutricional dos ingredientes da ração, reduzir custos e desperdícios, apoiar a saúde intestinal dos animais, melhorar a produtividade e melhorar o meio ambiente.
Além disso, as bactérias do ácido lático (LAB) por muito tempotêm sido usados para produzir alimentos fermentados, e recentemente o LAB foi desenvolvido para a expressão de proteínas recombinantes contendo uma sequência de aminoácidos, que pode ser amplamente utilizada, por exemplo, para melhorar a digestão humana, animal e nutricional.
No entanto, essas substâncias também têm limitações:
- Em alguns casos, a produção de proteínas recombinantes é complexa, cara e demorada.
- As substâncias produzidas nas células podem não corresponder às formas naturais. Essa diferença pode reduzir a eficácia das proteínas recombinantes terapêuticas e até causar efeitos colaterais. Além disso, essa diferença pode afetar os resultados dos experimentos.
- O principal problema com todas as drogas recombinantes é a imunogenicidade. Todos os produtos biotecnológicos podem apresentar alguma forma de imunogenicidade. É difícil prever a segurança de novas proteínas terapêuticas.
Em geral, os avanços na biotecnologia aumentaram e facilitaram a produção de proteínas recombinantes para diversas aplicações. Apesar de ainda apresentarem alguns inconvenientes, as substâncias são importantes na medicina, pesquisa e biotecnologia.
Vínculo da doença
proteína recombinante não é prejudicial aos seres humanos. É apenas uma parte integrante da molécula global no desenvolvimento de um determinado medicamento ou elemento nutricional. Muitos estudos médicos mostraram que a expressão forçada da proteína FGFBP3 (abreviada como BP3) em uma cepa de laboratório de camundongos obesos mostrou uma redução significativa em sua gordura corporal.massa, apesar da predisposição genética para uso.
Os resultados desses estudos mostram que a proteína FGFBP3 pode oferecer uma nova terapia para distúrbios associados à síndrome metabólica, como diabetes tipo 2 e doença hepática gordurosa. Mas como a BP3 é uma proteína natural e não uma droga artificial, os ensaios clínicos da BP3 humana recombinante podem começar após a rodada final de estudos pré-clínicos. Ou seja, existem razões relacionadas à segurança da realização de tais estudos. A proteína recombinante não é prejudicial aos seres humanos devido ao seu processamento e purificação passo a passo. As mudanças também estão ocorrendo no nível molecular.
PD-L2, um dos principais atores da imunoterapia, foi indicado ao Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2018. Este trabalho, iniciado pelo Prof. James P. Allison dos EUA e Prof. Tasuku Honjo do Japão, levou ao tratamento de cânceres como melanoma, câncer de pulmão e outros com base na imunoterapia de checkpoint. Recentemente, a AMSBIO adicionou um novo produto importante à sua linha de imunoterapia, o ativador PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
Em experimentos de prova de conceito, pesquisadores da Universidade do Alabama em Birmingham, liderados por H. Long Zheng, MD, Professor Robert B. Adams, e Diretor de Medicina Laboratorial, Departamento de Patologia, UAB School of Medicine, destacaram uma terapia potencial para um distúrbio hemorrágico raro, mas fatal, TTP.
Os resultados destaestudos demonstram pela primeira vez que a transfusão de plaquetas carregadas de rADAMTS13 pode ser uma abordagem terapêutica nova e potencialmente eficaz para a trombose arterial associada à PTT congênita e imunomediada.
A proteína recombinante não é apenas um nutriente, mas também um fármaco na composição do fármaco que está sendo desenvolvido. Estas são apenas algumas das áreas que agora estão envolvidas na medicina e relacionadas com o estudo de todos os seus elementos estruturais. Como mostra a prática internacional, a estrutura de uma substância torna possível, em nível molecular, lidar com muitos problemas sérios no corpo humano.
Desenvolvimento de vacinas
Uma proteína recombinante é um conjunto específico de moléculas que podem ser modeladas. Uma propriedade semelhante é usada no desenvolvimento de vacinas. Uma nova estratégia de vacinação, também conhecida como o uso de uma injeção especial de vírus recombinante, pode proteger milhões de galinhas em risco de uma doença respiratória grave, disseram pesquisadores da Universidade de Edimburgo e do Instituto Pirbright. Essas vacinas usam versões inofensivas ou fracas de um vírus ou bactéria para introduzir germes nas células do corpo. Nesse caso, os especialistas usaram vírus recombinantes com diferentes proteínas de pico como vacinas para criar duas versões de um vírus inofensivo. Existem muitas drogas diferentes construídas em torno dessa conexão.
Os nomes comerciais e análogos das proteínas recombinantes são os seguintes:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Estes são principalmente medicamentos anticancerígenos, mas existem outras áreas de tratamento associadas a esta substância ativa.
Uma nova vacina, também chamada LASSARAB, projetada para proteger as pessoas contra a febre de Lassa e a raiva, mostrou resultados promissores em estudos pré-clínicos, de acordo com um novo estudo publicado na revista científica Nature Communications. Uma candidata a vacina recombinante inativada usa um vírus da raiva enfraquecido.
A equipe de pesquisa inseriu material genético do vírus Lassa em um vetor de vírus da raiva para que a vacina expressasse proteínas de superfície nas células de Lassa e da raiva. Esses compostos de superfície provocam uma resposta imune contra agentes infecciosos. Esta vacina foi então inativada para "destruir" o vírus vivo da raiva usado para fazer o portador.
Métodos de Obtenção
Existem vários sistemas para a produção de uma substância. O método geral de obtenção de uma proteína recombinante é baseado na obtenção de material biológico a partir da síntese. Mas existem outras maneiras.
Atualmente existem cinco sistemas de expressão principais:
- Sistema de expressão de E. coli.
- Sistema de expressão de levedura.
- Sistema de expressão de células de insetos.
- Sistema de expressão celular de mamífero.
- Sistema de expressão de proteína livre de células.
Esta última opção é particularmente adequada para a expressão de proteínas transmembranarese compostos tóxicos. Nos últimos anos, as substâncias que são difíceis de expressar por métodos intracelulares convencionais foram integradas com sucesso em células in vitro. Na Bielorrússia, a produção de proteínas recombinantes é amplamente utilizada. Existem várias empresas estatais que lidam com esta questão.
Cell Free Protein Synthesis System é um método rápido e eficiente para sintetizar substâncias alvo, adicionando vários substratos e compostos energéticos necessários para transcrição e tradução no sistema enzimático de extratos celulares. Nos últimos anos, as vantagens dos métodos sem células para tipos de substâncias como membranas complexas e tóxicas surgiram gradualmente, demonstrando seu potencial de aplicação no campo biofarmacêutico.
A tecnologia sem células pode adicionar uma variedade de aminoácidos que não ocorrem naturalmente de maneira fácil e controlada para obter processos de modificação complexos que são difíceis de resolver após a expressão recombinante convencional. Tais métodos têm alto valor de aplicação e potencial para entrega de drogas e desenvolvimento de vacinas usando partículas semelhantes a vírus. Um grande número de proteínas de membrana foi expresso com sucesso em células livres.
Expressão de composições
A proteína recombinante CFP10-ESAT 6 é produzida e usada para criar vacinas. Esse alérgeno da tuberculose permite fortalecer o sistema imunológico e desenvolver anticorpos. Em geral, os estudos moleculares envolvem o estudo de qualquer aspecto de uma proteína, como estrutura, função, modificações, localização ou interações. Explorarcomo substâncias específicas regulam processos internos, os pesquisadores geralmente exigem os meios para produzir compostos funcionais de interesse e benefício.
Dado o tamanho e a complexidade das proteínas, a síntese química não é uma opção viável para este empreendimento. Em vez disso, as células vivas e sua maquinaria celular são geralmente usadas como fábricas para criar e construir substâncias com base nos modelos genéticos fornecidos. O sistema de expressão de proteínas recombinantes gera então a estrutura necessária para criar uma droga. Em seguida vem a seleção do material necessário para diferentes categorias de medicamentos.
Ao contrário das proteínas, o DNA é fácil de construir sinteticamente ou in vitro usando técnicas recombinantes bem estabelecidas. Portanto, moldes de DNA de genes específicos, com ou sem adição de sequências repórter ou sequências de marcadores de afinidade, podem ser projetados como moldes para expressão da substância monitorada. Tais compostos derivados de tais moldes de DNA são chamados de proteínas recombinantes.
As estratégias tradicionais para a expressão de uma substância envolvem a transfecção de células com um vetor de DNA que contém um molde e, em seguida, o cultivo das células para transcrever e traduzir a proteína desejada. Normalmente, as células são então lisadas para extrair o composto expresso para purificação subsequente. A proteína recombinante CFP10-ESAT6 é processada desta forma e passa por um sistema de purificação de possíveisa formação de toxinas. Só depois disso vai ser sintetizado em uma vacina.
Os sistemas de expressão in vivo procarióticos e eucarióticos para substâncias moleculares são amplamente utilizados. A escolha do sistema depende do tipo de proteína, da necessidade de atividade funcional e do rendimento desejado. Estes sistemas de expressão incluem mamíferos, insetos, leveduras, bactérias, algas e células. Cada sistema tem suas próprias vantagens e desafios, e escolher o sistema certo para uma aplicação específica é importante para a expressão bem-sucedida da substância em análise.
Expressão de mamíferos
O uso de proteínas recombinantes permite o desenvolvimento de vacinas e medicamentos de vários níveis. Para isso, esse método de obtenção de uma substância pode ser usado. Sistemas de expressão em mamíferos podem ser usados para produzir proteínas do reino animal que possuem a estrutura e atividade mais nativas devido ao seu ambiente fisiologicamente relevante. Isso resulta em altos níveis de processamento pós-traducional e atividade funcional. Os sistemas de expressão de mamíferos podem ser usados para produzir anticorpos, proteínas complexas e compostos para uso em ensaios funcionais baseados em células. No entanto, esses benefícios são associados a condições de cultura mais rigorosas.
Sistemas de expressão de mamíferos podem ser usados para gerar proteínas transitoriamente ou através de linhas celulares estáveis onde o construto de expressão é integrado ao genoma do hospedeiro. Embora tais sistemas possam ser usados em vários experimentos, o tempoprodução pode gerar uma grande quantidade de substância em uma a duas semanas. Este tipo de biotecnologia de proteína recombinante está em alta demanda.
Esses sistemas transitórios de expressão de mamíferos de alto rendimento usam culturas em suspensão e podem render gramas por litro. Além disso, essas proteínas têm mais dobras nativas e modificações pós-traducionais, como glicosilação, em comparação com outros sistemas de expressão.
Expressão do Inseto
Os métodos de produção de proteína recombinante não se limitam aos mamíferos. Existem também formas mais produtivas em termos de custos de produção, embora o rendimento da substância por 1 litro de líquido tratado seja muito menor.
Células de insetos podem ser usadas para expressar uma proteína de alto nível com modificações semelhantes aos sistemas de mamíferos. Existem vários sistemas que podem ser usados para gerar baculovírus recombinantes, que podem então ser usados para extrair a substância de interesse em células de insetos.
Expressões de proteínas recombinantes podem ser facilmente ampliadas e adaptadas à cultura em suspensão de alta densidade para composição de moléculas em larga escala. Eles são mais funcionalmente semelhantes à composição nativa da matéria mamífera. Embora o rendimento possa ser de até 500 mg/L, a produção de baculovírus recombinantes pode ser demorada e as condições de cultivo são mais difíceis do que os sistemas procarióticos. No entanto, em países mais meridionais e mais quentes, ummétodo é considerado mais eficiente.
Expressão bacteriana
A produção de proteínas recombinantes pode ser estabelecida com a ajuda de bactérias. Esta tecnologia é muito diferente das descritas acima. Os sistemas de expressão de proteínas bacterianas são populares porque as bactérias são fáceis de cultivar, crescem rapidamente e fornecem altos rendimentos da formulação recombinante. No entanto, substâncias eucarióticas de múltiplos domínios expressas em bactérias geralmente não são funcionais porque as células não estão equipadas para realizar as modificações pós-traducionais necessárias ou dobramento molecular.
Além disso, muitas proteínas se tornam insolúveis como moléculas de inclusão, que são muito difíceis de recuperar sem desnaturadores agressivos e procedimentos de redobramento molecular complicados subsequentes. Este método é considerado principalmente ainda em grande parte experimental.
Expressão livre de células
A proteína recombinante contendo a sequência de aminoácidos da estafiloquinase é obtida de maneira ligeiramente diferente. Está incluído em muitos tipos de injeções, exigindo vários sistemas antes do uso.
A expressão de proteína livre de células é uma síntese in vitro de uma substância usando extratos de células inteiras compatíveis com a tradução. Em princípio, os extratos de células inteiras contêm todas as macromoléculas e componentes necessários para transcrição, tradução e até modificação pós-tradução.
Esses componentes incluem RNA polimerase, fatores proteicos reguladores, formas de transcrição, ribossomos e tRNA. Ao adicionarcofatores, nucleotídeos e um modelo de gene específico, esses extratos podem sintetizar proteínas de interesse em poucas horas.
Embora não sejam sustentáveis para produção em larga escala, os sistemas de expressão proteica in vitro (IVT) sem células ou in vitro oferecem uma série de vantagens sobre os sistemas convencionais in vivo.
A expressão livre de células permite a síntese rápida de formulações recombinantes sem envolver a cultura de células. Os sistemas livres de células permitem marcar proteínas com aminoácidos modificados, bem como expressar compostos que sofrem rápida degradação proteolítica por proteases intracelulares. Além disso, é mais fácil expressar muitas proteínas diferentes ao mesmo tempo usando um método livre de células (por exemplo, testando mutações de proteínas por expressão em pequena escala de muitos modelos de DNA recombinante diferentes). Neste experimento representativo, o sistema IVT foi usado para expressar a proteína caspase-3 humana.
Conclusões e perspectivas futuras
A produção de proteína recombinante agora pode ser vista como uma disciplina madura. Este é o resultado de inúmeras melhorias incrementais na purificação e análise. Atualmente, os programas de descoberta de medicamentos raramente são interrompidos devido à incapacidade de produzir a proteína alvo. Processos paralelos para a expressão, purificação e análise de várias substâncias recombinantes são agora bem conhecidos em muitos laboratórios ao redor do mundo.
Complexos de proteínas e sucesso crescente na fabricaçãoestruturas de membrana solubilizadas exigirão mais mudanças para acompanhar a demanda. O surgimento de organizações de pesquisa contratadas eficazes para um fornecimento mais regular de proteínas permitirá a realocação de recursos científicos para enfrentar esses novos desafios.
Além disso, os fluxos de trabalho paralelos devem permitir a criação de bibliotecas completas da substância monitorada para permitir a identificação de novos alvos e triagem avançada, juntamente com projetos tradicionais de descoberta de drogas de pequenas moléculas.
