Absorção e posterior reemissão de luz por meios inorgânicos e orgânicos é o resultado de fosforescência ou fluorescência. A diferença entre os fenômenos é a duração do intervalo entre a absorção da luz e a emissão do fluxo. Com a fluorescência, esses processos ocorrem quase simultaneamente, e com a fosforescência, com algum atraso.
Histórico
Em 1852, o cientista britânico Stokes descreveu pela primeira vez a fluorescência. Ele cunhou o novo termo como resultado de seus experimentos com espatoflúor, que emitia luz vermelha quando exposto à luz ultravioleta. Stokes notou um fenômeno interessante. Ele descobriu que o comprimento de onda da luz fluorescente é sempre maior que o da luz de excitação.
Muitos experimentos foram realizados no século 19 para confirmar a hipótese. Eles mostraram que uma variedade de amostras fluorescem quando expostas à luz ultravioleta. Os materiais incluíam, entre outros, cristais, resinas, minerais, clorofila,matérias-primas medicinais, compostos inorgânicos, vitaminas, óleos. O uso direto de corantes para análises biológicas começou apenas em 1930
Descrição de microscopia de fluorescência
Alguns dos materiais usados nas pesquisas na primeira metade do século XX eram altamente específicos. Graças a indicadores que não podiam ser alcançados por métodos de contraste, o método de microscopia de fluorescência tornou-se uma ferramenta importante tanto na pesquisa biomédica quanto na biológica. Os resultados obtidos foram de grande importância para a ciência dos materiais.
Quais são os benefícios da microscopia de fluorescência? Com a ajuda de novos materiais, tornou-se possível isolar células altamente específicas e componentes submicroscópicos. Um microscópio fluorescente permite detectar moléculas individuais. Uma variedade de corantes permite identificar vários elementos ao mesmo tempo. Embora a resolução espacial do equipamento seja limitada pelo limite de difração, que, por sua vez, depende das propriedades específicas da amostra, a detecção de moléculas abaixo desse nível também é bastante possível. Várias amostras exibem autofluorescência após irradiação. Este fenômeno é amplamente utilizado em petrologia, botânica, indústria de semicondutores.
Recursos
O estudo de tecidos animais ou microorganismos patogênicos é muitas vezes complicado por autofluorescência não específica muito fraca ou muito forte. No entanto, o valor emA pesquisa adquire a introdução no material de componentes excitados em um comprimento de onda específico e emitindo um fluxo de luz com a intensidade necessária. Os fluorocromos atuam como corantes capazes de se auto-fixar nas estruturas (invisíveis ou visíveis). Ao mesmo tempo, eles se distinguem pela alta seletividade em relação aos alvos e rendimento quântico.
A microscopia de fluorescência tornou-se amplamente utilizada com o advento dos corantes naturais e sintéticos. Eles tinham perfis específicos de emissão e intensidade de excitação e visavam alvos biológicos específicos.
Identificação de moléculas individuais
Muitas vezes, em condições ideais, você pode registrar o brilho de um único elemento. Para fazer isso, entre outras coisas, é necessário garantir ruído de detector e fundo óptico suficientemente baixos. Uma molécula de fluoresceína pode emitir até 300.000 fótons antes da destruição devido ao fotobranqueamento. Com taxa de cobrança de 20% e eficiência de processo, podem ser cadastrados no valor de cerca de 60 mil
A microscopia de fluorescência, baseada em fotodiodos de avalanche ou multiplicação de elétrons, permitiu aos pesquisadores observar o comportamento de moléculas individuais por segundos e, em alguns casos, minutos.
Dificuldades
O principal problema é a supressão de ruído do fundo óptico. Devido ao fato de muitos dos materiais usados na construção de filtros e lentes apresentarem alguma autofluorescência, os esforços dos cientistas nos estágios iniciais se concentraram em emitircomponentes com baixa fluorescência. No entanto, experimentos subsequentes levaram a novas conclusões. Em particular, verificou-se que a microscopia de fluorescência baseada na reflexão interna total alcança uma saída de luz de fundo baixa e alta excitação.
Mecanismo
Os princípios da microscopia de fluorescência baseada na reflexão interna total são usar uma onda de decaimento rápido ou não propagante. Ele surge na interface entre meios com diferentes índices de refração. Neste caso, o feixe de luz passa por um prisma. Possui alto índice de refração.
O prisma é adjacente a uma solução aquosa ou vidro de baixo parâmetro. Se o feixe de luz for direcionado a ele em um ângulo maior que o crítico, o feixe é completamente refletido da interface. Esse fenômeno, por sua vez, dá origem a uma onda não propagadora. Em outras palavras, é gerado um campo eletromagnético que penetra em um meio com menor índice de refração a uma distância inferior a 200 nanômetros.
Em uma onda não propagante, a intensidade da luz será suficiente para excitar os fluoróforos. No entanto, devido à sua profundidade excepcionalmente rasa, seu volume será muito pequeno. O resultado é um plano de fundo de baixo nível.
Modificação
A microscopia de fluorescência baseada na reflexão interna total pode ser realizada com epi-iluminação. Isso requer lentes com abertura numérica aumentada (pelo menos 1,4, mas é desejável que atinja 1,45-1,6), bem como um campo parcialmente iluminado do aparelho. Este último é conseguido com uma pequena mancha. Para maior uniformidade, é utilizado um anel fino, através do qual parte do fluxo é bloqueado. Para obter um ângulo crítico após o qual ocorre a reflexão total, é necessário um alto nível de refração do meio de imersão nas lentes e na vidraça do microscópio.
